一、研究背景

心血管疾病是目前全球死亡的主要原因。僅在美國，每年就有近 25 萬例針對外周和冠狀動(dòng)脈病變的開放性血管重建手術(shù)。預(yù)計(jì)到 2030 年，將有近 2330 萬人死于冠心病和心臟病發(fā)作。雖然原生靜脈和動(dòng)脈切片仍是通過外周冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)修復(fù)缺損血管的最佳方法，但當(dāng)自體血管閉塞或病變，或其大小與缺損側(cè)不一致時(shí)，其可用性就會(huì)受到限制。30%的患者無法獲得合適的原生靜脈，因此，使用生物相容性生物材料的人工血管移植物需求量很大。設(shè)計(jì)多層血管支架被認(rèn)為是模擬原生血管結(jié)構(gòu)和功能的有效方法。其中，電紡絲是獲得血管支架的有效方法之一，因?yàn)橥ㄟ^混合各種材料和構(gòu)建非分層層更容易開發(fā)多層支架。靜電紡絲設(shè)備利用高壓靜電場生成纖維結(jié)構(gòu)，提供類似于原生血管細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的生物仿真細(xì)胞環(huán)境。電紡絲可制造納米到微米尺度的纖維基質(zhì)，并控制支架的成分、結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性。該技術(shù)可利用各種天然聚合物（如膠原蛋白和纖維蛋白）以及各種合成聚合物（如聚ε-己內(nèi)酯（PCL）、聚（L-內(nèi)酯）（PLLA）和聚（D-內(nèi)酯）（PDLA），此外還有共聚物聚（L-內(nèi)酯己內(nèi)酯）（P(LLA-CL) 和聚（D,L-內(nèi)酯-共聚乙二醇）（PLGA）。

膠原蛋白等天然聚合物源于生物，非常適合各種體內(nèi)應(yīng)用。它通過模擬原生 ECM 的關(guān)鍵機(jī)械生物學(xué)和生物化學(xué)特征，促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長。然而，大多數(shù)市售的膠原蛋白都取自動(dòng)物產(chǎn)品，如肌腱、皮膚和骨骼，這讓人對其質(zhì)量、純度、疾病傳播和過敏反應(yīng)產(chǎn)生擔(dān)憂。另外，分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展使研究人員能夠生產(chǎn)出可靠的、化學(xué)定義明確的重組人膠原蛋白肽（RHC），且不會(huì)引起過敏。例如，根據(jù) III 型人膠原蛋白的 mRNA 序列，設(shè)計(jì)并合成了密碼子優(yōu)化的重組人膠原蛋白多肽單體基因。然后，將表達(dá)載體（pPIC9KG6）轉(zhuǎn)化到 Pichia pastoris 中。隨后，從轉(zhuǎn)化子中篩選出高水平表達(dá)菌株進(jìn)行高細(xì)胞密度發(fā)酵。在我們之前的研究中，基于 RHC 的生物材料已被開發(fā)成多孔支架和水凝膠。因此，我們選擇 RHC 作為制備納米纖維的生物材料。然而，僅用膠原蛋白制備的支架通常粘彈性較差，分解速度快，未交聯(lián)時(shí)降解速度快且機(jī)械性能不穩(wěn)定。另一方面，PCL 的降解速度較慢、成本較低、具有獨(dú)特的流變和粘彈特性。此外，它還是一種公認(rèn)的用于特定長期植入的模型生物材料。因此，本研究采用納米纖維尺度制作了含有 RHC 和 PCL 的復(fù)合支架。

在模擬自體移植物時(shí)，需要具有接近原生血管機(jī)械和結(jié)構(gòu)特性的支架。血管有三個(gè)不同的層次：內(nèi)膜、中膜和外膜，它們將血液、氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)輸送到重要的組織和器官。內(nèi)膜由一層內(nèi)皮細(xì)胞組成，襯于血管內(nèi)表面，起著吸收性生物聚合物膜的作用。內(nèi)皮細(xì)胞分泌可溶性因子，以維持止血和血管壁的抗血栓形成特性。中膜和外膜包含平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，具有明顯的周向取向，以提供承受循環(huán)系統(tǒng)高壓所需的機(jī)械強(qiáng)度。因此，理想的血管移植物管狀支架可能是由納米纖維膜作為內(nèi)層、具有較大孔隙的多孔層作為外層組成的雙層移植物。不同的研究小組已嘗試制造雙層和多層移植物。

電紡絲制造的移植物通?？紫遁^小，孔隙率較低，這兩種情況都限制了細(xì)胞的浸潤。已有許多技術(shù)被用于改善孔徑，如利用鹽、低溫電紡、增加溶液濃度、使用痕化聚合物或帶氣體發(fā)泡的電紡等。在本研究中，為了制作多孔外層，在共電紡工藝中使用了犧牲纖維。聚環(huán)氧乙烷（PEO）具有高水溶性和足夠的粘度，是形成犧牲纖維的最佳候選材料之一。Baker 等人首次引入了這種 PCL 和 PEO 纖維的組合，通過將 PEO 纖維溶解在水中來犧牲 PEO 纖維，從而生產(chǎn)出具有大孔隙且纖維纏結(jié)減少的 PCL 支架。

在本研究中，我們假設(shè)可以通過洗掉 PEO 纖維來擴(kuò)大血管外壁的孔隙，以適應(yīng)大鼠平滑肌細(xì)胞（A7r5）的浸潤，同時(shí)在管腔附近保留一層直徑較小的纖維，以促進(jìn)連續(xù)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）層的粘附。

二、摘要

心血管疾病，包括冠狀動(dòng)脈和外周血管病變，是導(dǎo)致死亡的主要原因。為了降低死亡率，人們開發(fā)了人工血管移植物來替代自體移植物。本研究介紹了具有適當(dāng)結(jié)構(gòu)和生物相容性的雙層血管移植物的開發(fā)和表征。研究采用重組人膠原蛋白（RHC）肽和聚己內(nèi)酯（PCL）的聚合物混合物，通過電紡絲構(gòu)建移植物的內(nèi)層，并將水溶性聚氧化乙烯（PEO）作為犧牲材料與 PCL 共同電紡絲生成多孔外層。力學(xué)測試表明，與原生血管結(jié)構(gòu)相比，雙層支架具有適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）在納米纖維上播種后，與管腔的粘附性得到了增強(qiáng)。同時(shí)，通過去除 PEO 纖維來提高微纖維外層的孔隙率，大鼠平滑肌細(xì)胞（A7r5）可以增殖并輕松滲入多孔層。

三、結(jié)論

為了模擬原生血管的多層形態(tài)，我們利用靜電紡絲設(shè)備 RHC 和 PCL 的方法，開發(fā)出了一種具有纖維內(nèi)層和多孔外層的雙層支架。內(nèi)纖維層是通過電紡絲 PCL/RHC（2:1）聚合物溶液制成的，可使 HUVEC 黏附到管腔表面。此外，PCL 和 PEO 溶液與犧牲的 PEO 纖維共同電紡絲制成了預(yù)定義的多孔外層，可使 A7r5 均勻滲入該層。結(jié)果表明，這種支架具有生物相容性、可生物降解、易于制造，并能支持細(xì)胞粘附和浸潤。此外，雙層支架還具有足夠的機(jī)械性能，能承受生理相關(guān)的血管條件。因此，它為進(jìn)一步的體內(nèi)研究提供了一種可行的方法，以全面評估這種支架作為潛在人造血管的性能和機(jī)械特性。

圖1.雙層支架的制造過程示意圖：內(nèi)層的制備（A），支架外層的共電紡（B），去除 PEO 纖維（C）。

 

圖2.支架橫向（A1）和橫截面（A2）的數(shù)字圖像。雙層支架橫截面的掃描電鏡圖像（B1）和兩層之間界面的高倍放大圖像（B2）。不同比例的電紡內(nèi)層（PCL/RHC）：(C1) (2:1)、(C2) (1:1)、(C3) (1:2) 和 (C4) (1:0)，以及外層（PCL/PEO）（D1）：洗去 PEO 之前和（D2）：洗去 PEO 之后的 SEM 圖像。