一、研究背景

肌腱是連接肌肉和骨骼的結(jié)締組織，是肌肉骨骼系統(tǒng)的重要組成部分，在運(yùn)動(dòng)過程中儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)移能量。肌腱由沿其縱軸排列的膠原纖維束組成。肌腱中膠原纖維的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的：涉及到原膠原、膠原原纖維、膠原纖維和筋束的形成。最后，肌腱基質(zhì)由肌束組成。膠原纖維直徑為1 ~ 20 μm。然而，由于意外事故或過度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肌腱部分或完全斷裂，可引起膠原同型表達(dá)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，破壞膠原排列，導(dǎo)致功能喪失，活動(dòng)能力降低。

值得注意的是，肌腱具有壓電特性，可以將機(jī)械能轉(zhuǎn)化為電能，而壓電行為與膠原蛋白有關(guān)。內(nèi)源電場(chǎng)是生物電信號(hào)傳導(dǎo)的基礎(chǔ)，是損傷組織再生的優(yōu)先信號(hào)。研究表明，生理運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的生物電信號(hào)可以激活肌腱特異性再生途徑。因此，通過控制肌腱內(nèi)的生物電來加速肌腱細(xì)胞的遷移，從而促進(jìn)肌腱的修復(fù)是可行的。眾所周知，電刺激（ES）促進(jìn)細(xì)胞定向遷移和排列，影響細(xì)胞增殖和分化，影響細(xì)胞膜的收縮性、通透性和能量傳遞，并調(diào)節(jié)pH變化。因此，ES可以引導(dǎo)許多組織的發(fā)育和再生。例如，Carla等人證實(shí)，micro-ES加速了動(dòng)物非關(guān)節(jié)部位的軟骨修復(fù)。

手術(shù)的復(fù)雜性和外部ES可導(dǎo)致頻繁的術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)。因此，有必要利用可植入的生物材料，在生物體內(nèi)的生物電信號(hào)影響下自發(fā)導(dǎo)電，以促進(jìn)組織修復(fù)。導(dǎo)電生物材料固有的導(dǎo)電性使得離子信號(hào)在細(xì)胞過程中傳遞，可以在各種組織類型中指導(dǎo)細(xì)胞的定向排列，促進(jìn)細(xì)胞分化。導(dǎo)電性生物材料在組織工程中得到了廣泛的應(yīng)用，包括碳納米管、碳納米紗以及石墨烯與金屬顆粒（如金納米顆粒）的混合生物材料。

理想情況下，用于肌腱修復(fù)和再生的工程支架需要足夠的強(qiáng)度來承受大的循環(huán)載荷，抵抗長(zhǎng)期的蠕變變形，并允許營養(yǎng)物質(zhì)和廢物的有效轉(zhuǎn)移。根據(jù)最初的研究，碳纖維（CF）表現(xiàn)出最小的異物感，并且可以被新的膠原組織浸潤。Wang等人開發(fā)了層狀螺旋碳納米管纖維作為韌帶替代品，具有生物相容性和高拉伸強(qiáng)度。碳納米管纖維與天然骨骼結(jié)合良好，足夠堅(jiān)固，在植入兔子和綿羊13周后，動(dòng)物可以正常奔跑和跳躍。Howard等人使用CF修復(fù)人類跟腱斷裂，結(jié)果顯示大多數(shù)患者跟腱愈合良好。說明CF具有導(dǎo)電性、生物相容性和良好的力學(xué)性能，作為肌腱的替代支架具有潛在價(jià)值。然而，每束CF是由多個(gè)單絲組成的，這些單絲非常松散。靜電紡絲是一種可用于制造各種形式納米纖維的技術(shù)。有趣的是，通過靜電紡絲，CF可以被包裹并作為穩(wěn)定的獨(dú)立支架使用。聚乳酸（PLA）是一種生物相容性和可生物降解的醫(yī)用聚合物，經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砗?，它表現(xiàn)出壓電特性，可以制造更安全的植入物，例如通過高速旋轉(zhuǎn)滾輪生產(chǎn)的用于軟骨再生的電紡絲聚乳酸膜。絲素蛋白（Silk fibrin， SF）具有良好的生物相容性，可與多種導(dǎo)電材料混合制備基于絲素蛋白的導(dǎo)電支架，用于組織修復(fù)。

在這項(xiàng)研究中，通過靜電紡絲機(jī)器獲得了一束芯紡紗，其中外殼層為聚乳酸/聚苯乙烯納米纖維膜，芯層為纖維素酯。然后，將多根包芯紗組合起來并再次紡絲，就得到了可修復(fù)缺損肌腱的三維 CF 介導(dǎo)電紡絲支架。直徑為 5.07 ± 1.20 μm 的定向 CF 單絲被用來模擬肌腱中的膠原纖維。納米纖維膜模擬了肌腱中包裹膠原纖維的結(jié)締組織。因此，我們希望導(dǎo)電 CF 能替代肌腱缺損部位缺失的膠原纖維，并在機(jī)體內(nèi)源性電場(chǎng)的作用下產(chǎn)生電信號(hào)，從而加速細(xì)胞遷移、增殖、分化和表達(dá)，最終促進(jìn)肌腱修復(fù)。本研究選擇不導(dǎo)電的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯紗線和 CF 作為對(duì)照，以驗(yàn)證 CF 介導(dǎo)的電紡支架是否能促進(jìn)肌腱修復(fù)。

二、摘要

肌腱部分或完全斷裂可破壞膠原蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致電信號(hào)通路中斷。重建肌腱的原始電信號(hào)通路，促進(jìn)缺損肌腱的再生和功能恢復(fù)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。在這項(xiàng)研究中，碳纖維介導(dǎo)的靜電紡絲支架是由納米纖維膜包裹導(dǎo)電、高強(qiáng)度、松散的單束碳纖維制成的。由于納米纖維膜的存在，支架的最大拉伸力是碳纖維的2.4倍，同時(shí)為細(xì)胞適應(yīng)電刺激加速增殖和表達(dá)提供了良好的時(shí)間和空間條件。本研究使用的碳纖維單絲直徑為5.07±1.20 μm，與肌腱膠原的直徑相匹配，可以快速建立肌腱組織與支架之間的連接，更好地促進(jìn)電信號(hào)通路的恢復(fù)。在兔跟腱缺損修復(fù)模型中，與不導(dǎo)電的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯支架相比，碳纖維介導(dǎo)的靜電紡絲支架幾乎充滿了膠原纖維。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，纖維調(diào)節(jié)素和腱調(diào)節(jié)素表達(dá)上調(diào)，其相關(guān)蛋白聚糖和糖胺聚糖結(jié)合蛋白通路增強(qiáng)，可調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路，優(yōu)化細(xì)胞外基質(zhì)組裝，從而促進(jìn)肌腱修復(fù)。因此，本研究的支架彌補(bǔ)了導(dǎo)電性支架修復(fù)肌腱缺損的不足，揭示了導(dǎo)電性對(duì)肌腱修復(fù)信號(hào)通路的潛在影響，為今后的臨床研究提供了新的途徑。

三、結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了碳纖維介導(dǎo)的電紡支架。該 CPS 中增強(qiáng)核心 CF 的直徑與膠原纖維的直徑相似，可促進(jìn)體內(nèi)缺損肌腱消失的內(nèi)源性電場(chǎng)的快速恢復(fù)。CPS 表面的納米纖維膜可幫助腱細(xì)胞適應(yīng) ES，加速增殖和表達(dá)。兔跟腱缺損試驗(yàn)表明，CPS更有利于膠原纖維的生成。通過RNA-seq研究發(fā)現(xiàn)，肌腱修復(fù)與TGF-β信號(hào)通路有關(guān)，CPS能上調(diào)FMOD和TNMD的表達(dá)，共同促進(jìn)肌腱修復(fù)。

圖1.CPS 的制備和應(yīng)用示意圖。首先，通過電紡獲得包芯紗，其中增強(qiáng)芯為 CF，納米纖維膜為 PLA/SF。其次，將三束包芯紡絲合并并再次紡絲，以獲得更厚的以 CF 為介導(dǎo)的支架。然后，將腱鞘細(xì)胞播種到 CPS 上，并在體外給予 ES，ES 可影響腱鞘細(xì)胞的遷移、增殖和排列。最后，將 CPS 植入兔子的跟腱缺損區(qū)，在機(jī)體內(nèi)源性電場(chǎng)的作用下，CPS 可促進(jìn)肌腱修復(fù)。

圖2.1 周、2 周、4 周、8 周和 12 周后 CPS 的降解情況。掃描電子顯微鏡（a），刻度線 = 5 微米，刻度線 = 20 微米。質(zhì)量損失率（b）。冷凍干燥后的宏觀圖（c）和機(jī)械拉伸后的宏觀圖（d），刻度線 = 1 厘米。應(yīng)力-應(yīng)變曲線（e）、UTS（f）、失效應(yīng)變（g）、楊氏模量（h）和最大力（i）。黃綠虛線：納米纖維斷裂放大圖。紅色箭頭：其他納米纖維斷裂。藍(lán)色箭頭：脫落的納米纖維膜。

圖3.修復(fù)跟腱缺損。0、4 和 12 周后 PET 和 CPS 支架植入缺損區(qū)域的宏觀圖（a），比例尺 = 5 毫米，組織學(xué)評(píng)分（b），膠原擴(kuò)散區(qū)域（c），HE 染色（d）和 MT 染色（e），比例尺 = 100 μm，比例尺 = 200 μm。橙色箭頭：肌纖維。綠色箭頭：膠原纖維。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。