一、研究背景

骨缺損的修復和治療仍然具有挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的骨組織修復方法包括自體骨移植、異體骨移植和骨水泥填充，但每種方法都有其不足之處。目前，隨著組織工程技術的發(fā)展，生物相容性好、細胞毒性低、骨誘導能力強的組織工程支架在骨修復研究中得到越來越多的應用。

目前，骨再生常用的支架制造方法有熱誘導相分離、真空干燥、3D打印、利用靜電紡絲設備等。熔融電寫（MEW）是一種新興的3D打印技術，可以精確沉積具有預設圖案的纖維，以生產(chǎn)具有3D結構的高度有序微米級支架，，已廣泛用于制造組織工程支架。與傳統(tǒng)的擠壓3D打印技術（如熔絲沉積建模（FDM））相比，通過MEW制造的支架由于電場的拉伸而提供了更高的分辨率。因此，MEW支架具有更小的纖維直徑，更大的孔隙率，并且更接近細胞外基質(zhì)（ECM）的尺寸，從而顯示出對細胞生長和組織工程的促進作用。與水凝膠和納米纖維相比，MEW支架除了具有精確可控的纖維堆疊外，還具有更好的力學性能，可在骨缺損區(qū)域提供更強的機械支撐。MEW支架在骨組織工程中的應用和優(yōu)勢已經(jīng)得到了廣泛的研究。Abbasi等人證明，具有明確孔隙結構的MEW支架可以支持高度的細胞增殖和成骨細胞的浸潤。Xiong等人通過模擬天然骨-韌帶界面制備了MEW仿生網(wǎng)格卷曲纖維模式，驗證了MEW晶格結構具有優(yōu)異的成骨誘導能力。盡管MEW支架具有諸多優(yōu)點，但在骨修復方面仍存在一些不足。首先，與納米級細胞外基質(zhì)（ECM）相比，MEW生產(chǎn)的大多數(shù)纖維都在幾微米到幾十微米之間。其次，雖然聚（ε-己內(nèi)酯）（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）等常用的合成材料具有良好的生物相容性、可加工性和力學性能，但其較差的生物活性和疏水性不利于細胞粘附和生長。溶液靜電紡絲（SES）是一種利用遠場靜電力制備納米纖維的技術。由SES生產(chǎn)的納米纖維具有幾個有利的特性，包括大孔隙率、高比表面積和與天然ECM相似的形態(tài)，這些特性已被廣泛用于促進組織修復和再生。鑒于成骨細胞是錨定依賴性細胞，納米纖維的上述特性可以增強成骨細胞的粘附和遷移。此外，已經(jīng)證明SES適用于200多種聚合物，還可以在聚合物溶液中添加其他物質(zhì)以實現(xiàn)特殊功能。Chakraborty等人發(fā)現(xiàn)再生纖維素納米纖維支架具有良好的力學和化學性能，有利于成骨細胞的粘附和增殖。 Suryavanshi等人利用SES法制備了負載氧化鎂納米顆粒（MgO NP）的PCL骨-軟組織工程支架，并證明該支架具有更好的力學性能和體外生物學性能。盡管大量研究表明納米纖維有利于成骨細胞的粘附和增殖，但由于納米纖維的加工方法難以制造出具有足夠高度和孔隙度的三維結構支架，這限制了細胞向內(nèi)生長和骨缺損再生。同時，SES納米纖維的力學性能相對較弱，阻礙了其在骨組織工程中的應用。

研究表明，微納米復合支架的微結構和納米結構通過激活成骨細胞的多種受體，促進成骨分化和骨再生。MEW微纖維支架與SES納米纖維的結合可以提供機械支撐和有利于細胞生長的微環(huán)境。該解決方案克服了兩者的缺點，同時利用了它們的優(yōu)點。之前，我們將MEW和SES結合成功制備了含有PCL微纖維網(wǎng)格和明膠納米纖維的復合支架，表明微觀結構和納米纖維可以協(xié)同提高骨修復效果。

除了結構的影響外，支架的組成對骨修復的效果也至關重要。羥基磷灰石（HAP）是人類和動物骨骼的主要無機成分，由于其顯著的生物活性、可降解性和骨導電性，近幾十年來被廣泛應用于牙科、抗腫瘤藥物輸送和骨修復。例如，Sadeghianmaryan等人證明，在3D打印的殼聚糖/海藻酸鹽支架中添加HAP可以改善軟骨細胞的增殖。此外，在提高骨形成能力的同時，骨組織工程支架還需要抵抗植入引起的細菌感染，避免對修復的骨組織造成二次損傷。抗生素是臨床上最常用的骨感染預防手段。目前的研究表明，局部抗生素治療可以提高藥物的生物利用度，減輕后續(xù)藥物干預的不良反應。因此，在骨組織工程支架中加載抗生素是避免骨感染的有利手段。骨感染通常是由葡萄球菌屬的病原體引起的，尤其是金黃色葡萄球菌。羅紅霉素（Roxithromycin， ROX）是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及部分厭氧菌均有良好的抗菌作用。之前，我們成功制備了含有ROX的MEW PCL支架，該支架已被證明有利于預防和治療骨感染。

本研究開發(fā)了一種由rox封裝的MEW微纖維網(wǎng)格和HAP負載的SES納米纖維組成的微納米復合抗菌/成骨骨組織工程支架。采用掃描電鏡（SEM）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、吸水性測定和力學分析等方法評價復合支架的理化特性。采用體外釋放試驗和抗菌試驗對復合支架的ROX釋放行為和抗菌活性進行表征。研究了復合支架對成骨細胞行為的影響。最后，將復合支架植入大鼠顱骨缺損模型，在體內(nèi)評估其骨修復能力。

二、摘要

與單個納米或微米大小的支架相比，微納米復合支架在骨修復方面的優(yōu)勢已被廣泛證實。然而，如何提高這些復合支架的生物活性仍是一項挑戰(zhàn)。在本研究中，我們提出了一種結合熔融電泳（MEW）和溶液電紡（SES）技術的新方法，用于制造一種含有羥基磷灰石（HAP）（一種成骨成分）和羅紅霉素（ROX）（一種抗菌活性成分）的復合支架。掃描電子顯微鏡（SEM）和傅立葉變換紅外光譜（FTIR）證實了支架內(nèi)納米纖維-微網(wǎng)格的分層結構，以及 HAP 和 ROX 的成功負載。HAP 的加入增強了復合支架的吸水能力，從而促進了細胞的粘附和增殖以及成骨分化。此外，ROX 還具有有效的抗菌能力，且無明顯的細胞毒性。最后，將支架應用于大鼠腓骨缺損模型，結果表明，20% HAP 組的新骨形成效果更佳，且不會引起不良反應。因此，我們的研究結果為設計和制造用于骨再生的生物活性支架提供了一種前景廣闊的策略。

三、結論

本研究成功制備了由ROX包封的MEW微纖維網(wǎng)格和hap負載的SES納米纖維組成的微納米復合抗菌-成骨骨組織工程支架。負載rox的微纖維網(wǎng)格具有機械強度和抗菌活性，而負載hap的納米纖維可以模擬ECM，促進成骨細胞的粘附、增殖和成骨分化。吸水率測試證明HAP的加入提高了復合支架的親水性。復合支架中的ROX表現(xiàn)出最初的爆發(fā)性釋放和隨后的延長釋放行為。此外，復合支架在抗菌實驗中表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，特別是對革蘭氏陽性細菌。復合支架也被證明具有良好的細胞相容性，HAP的加入可以進一步促進成骨細胞的粘附和增殖。ALP活性、ARS染色、RT-qPCR均顯示復合支架明顯促進成骨，其中20% HAP組成骨活性最好。最后，體內(nèi)骨修復實驗表明，20% HAP組顯著提高大鼠顱骨缺損修復水平，無不良反應。因此，MEW和SES制備的雙功能微納米復合支架具有相當大的骨組織工程應用潛力。

圖1.PCL/ROX/HAP 微納米復合材料支架的制作（A）和應用（B）示意圖。

圖2.(A)細胞在復合支架上培養(yǎng)24小時的活/死染色圖像。(B)細胞在復合支架上培養(yǎng)第1、2、3天的CCK-8分析。(C)復合支架上細胞培養(yǎng)48h后的免疫染色圖像。細胞骨架用Phalloidin染色為橙色，細胞核用DAPI染色為藍色。**與對照組比較p < 0.01，與PCL組比較&&p < 0.01。

圖3.新骨形成的組織學評價。(A)術后4周和12周顱骨缺損區(qū)H&E染色。(B)術后4周和12周顱骨缺損區(qū)馬松三色染色。