一、研究背景

骨骼在人體中扮演著許多重要的角色，為肌肉和其他組織提供結(jié)構(gòu)框架，促進運動，保護內(nèi)部器官免受傷害。由骨腫瘤、骨損傷和其他骨骼疾病引起的大骨缺損往往不能通過人體的自然修復機制自愈。因此，無論是天然的還是合成的骨移植物，都需要用于替換患病或缺失的骨。雖然傳統(tǒng)的移植技術是有效的，但它們可能導致手術并發(fā)癥和不理想的結(jié)果。這推動了組織工程解決方案的興起，特別是骨組織工程，作為有前途的替代方案。

在骨組織工程的發(fā)展過程中，利用生物材料結(jié)合干細胞構(gòu)建的支架在體外進行2-3周的骨誘導，然后植入動物骨缺損部位，取得了良好的骨缺損修復效果。靜電紡絲技術是骨組織工程組織工程支架的一種常用技術。在靜電紡絲過程中，前驅(qū)體溶液在高壓電場作用下由液滴轉(zhuǎn)變?yōu)榧毨w維。收集的超細纖維形成纖維膜，模擬細胞外基質(zhì)，為細胞增殖和成骨提供了有利的環(huán)境。我們之前的工作已經(jīng)證實了這一點。盡管電紡絲支架具有顯著的優(yōu)勢，但也有其局限性，其中之一是支架內(nèi)外的種子細胞分布不均勻，導致細胞浸潤性差。為了克服這一限制，提出了一種新的方法——電池靜電紡絲（CES）。CES是一種基于靜電紡絲的技術，它生產(chǎn)的纖維可以嵌入活細胞。CES與傳統(tǒng)靜電紡絲的主要區(qū)別在于使用活細胞，為我們的實驗提供了即時的植入條件。

除了制造技術外，生物材料在骨組織工程中也是不可或缺的。生物材料的選擇至關重要。聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）（P34HB）是一種聚羥基烷酸酯衍生物，因其機械穩(wěn)健性、生物相容性和可生物降解性而脫穎而出。其優(yōu)越的表面性能進一步增強了其作為支架材料的吸引力。因此，P34HB作為生物活性分子持續(xù)釋放的載體或可降解的植入材料獲得了極大的興趣。我們的初步研究證實其具有良好的生物相容性、生物可降解性和促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用。在本研究中，我們繼續(xù)使用P34HB開發(fā)用于成骨的CES纖維支架。

此外，ASP、β-甘油磷酸鈉（GP）和地塞米松（DEX）是成骨細胞誘導培養(yǎng)基中必需的補充物。在體外，抗壞血酸已被證明能促進成骨細胞分化。由于抗壞血酸的強還原性，它在外界環(huán)境中的穩(wěn)定性相對較低。ASP是抗壞血酸的長效衍生物，由于其穩(wěn)定性好，功能相似，在特定應用中逐漸取代抗壞血酸。在骨基質(zhì)礦化研究中，甘油三酯作為磷酸基供體。DEX是一種廣泛使用的合成糖皮質(zhì)激素，可促進成骨細胞的分化。然而，關于這三種成分在體內(nèi)誘導干細胞成骨的報道很少。Wang等人制備了具有抗壞血酸、β-甘油磷酸酯和DEX緩釋的賴氨酸二異氰酸酯成骨支架，研究了其對干細胞的體外成骨誘導能力。然而，將這三種誘導成分與CES技術結(jié)合，立即植入并探索其體內(nèi)成骨誘導能力仍未得到探索。在載藥電紡絲纖維的研究中，高濃度的藥物往往分布在纖維表面，并表現(xiàn)出最初的爆裂釋放。核殼噴嘴制備的納米纖維可以將藥物限制在核心層，這有望限制藥物在初始階段的釋放。同軸靜電紡絲是制備芯-殼纖維的常用方法。通過這種技術，藥物可以被包裹在纖維內(nèi)，并且隨著包封率的增加，藥物的釋放時間可以有效延長。

在這項研究中，我們介紹了一種新型的基于p34hb的光纖緩釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用雙噴嘴CES制作。結(jié)合核殼噴嘴，該系統(tǒng)將HUCMSCs嵌入裝載ASP， GP和DEX的P34HB纖維中，以便立即在體內(nèi)應用。它持續(xù)促進HUCMSCs的成骨分化。

二、摘要

本研究介紹了聚（3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸）（P34HB）超細纖維緩釋系統(tǒng)的開發(fā)和評價，該系統(tǒng)用于人臍帶間充質(zhì)干細胞（HUCMSCs）的體內(nèi)成骨誘導。該系統(tǒng)通過靜電紡絲設備利用雙噴嘴和細胞靜電紡絲技術，將l-抗壞血酸-2-磷酸鎂（ASP）、β-甘油磷酸鈉和地塞米松（DEX）包裹在纖維中，確保持續(xù)的成骨分化。研究了支架的形態(tài)、表征、親水性、力學性能和細胞行為。采用兔即刻皮下植入法觀察其異位成骨誘導作用。成功制備了P34HB超細纖維緩釋體系。表征證實了支架內(nèi)HUCMSCs和誘導成分分布均勻，沒有化學反應影響活性成分。體外測試顯示，DEX和ASP的釋放時間較長，而生物相容性測試則突出了支架對細胞生長的適應性。茜素紅、I型膠原和骨橋蛋白（OPN）染色證實了支架對HUCMSCs的強效成骨誘導作用。值得注意的是，立即植入新西蘭大白兔，在8周內(nèi)形成了明顯的新骨。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了該系統(tǒng)無需體外誘導即可立即在體內(nèi)植入的潛力，標志著骨組織工程的一個有希望的進展。

三、結(jié)論

在這項研究中，我們利用雙噴嘴和 CES 成功開發(fā)出了 P(AGD)-CES 超細纖維緩釋系統(tǒng)，無需事先進行體外誘導即可立即植入體內(nèi)。體外和體內(nèi)實驗均證明，該系統(tǒng)具有促進 HUCMSCs 成骨分化的潛力，這凸顯了它作為新型治療工具的前景。鑒于 P(AGD)-CES 系統(tǒng)的生物仿生屬性、機械堅固性、生物相容性和持續(xù)釋放能力，它為臨床治療骨缺損提供了一種創(chuàng)新方法。本研究的不足之處在于缺乏體內(nèi)成骨標志物分析和原位成骨評估。后續(xù)研究將進一步改進。

圖1.光纖緩釋體系的形態(tài)觀察和能量色散x射線分析。含ASP、GP和DEX的P（AGD）纖維的光學顯微鏡觀察(A)、透射電鏡(B)和掃描電鏡(C)、純P34HB纖維的掃描電鏡(D)、CES纖維慢釋體系的掃描電鏡(E)、P（AGD）和P34HB的EDX分析及其元素含量（F、G）。白色箭頭指向包封在超細纖維中的DEX、ASP和GP。

圖2.纖維緩釋系統(tǒng)的親水性測試、體外降解、生物相容性和增殖粘附電鏡觀察。緩釋系統(tǒng)在 0、15 和 30 秒時的接觸角（A）、膨脹率（B）、體外降解曲線（C）、CES 第 1 天的細胞存活率（E）、細胞/支架體外培養(yǎng) 7 天和 14 天的細胞增殖（D）、7 天和 14 天的活體/死體染色成像（F）、7 天和 14 天 HUCMSCs 在生物活性纖維膜上的掃描電鏡（G）。白色箭頭指向包裹在超細纖維中的 DEX、ASP 和 GP，黃色箭頭指向干細胞（比例尺：500 μm，20 μm）。*p < 0.1，**p < 0.01。