一、研究背景

靜電紡絲是一種通過(guò)在針狀噴嘴內(nèi)對(duì)聚合物溶液施加高壓靜電力來(lái)制造納米纖維的技術(shù)。納米纖維的物理性質(zhì)可以通過(guò)改變聚合物、溶劑和溶液流速等參數(shù)以及施加電壓來(lái)調(diào)節(jié)。靜電紡絲的特點(diǎn)是由于納米纖維的高表面積使其溶劑蒸發(fā)迅速，從而使其能夠在室溫下制造。這種能力使其在組織工程、再生醫(yī)學(xué)、制備傷口敷料和合成藥物制劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。一般來(lái)說(shuō)，靜電紡絲包括對(duì)溶液施加10至40千伏的高壓，但電流在微安范圍內(nèi)非常低；因此，能源消耗也很低。這一過(guò)程在室溫下進(jìn)行，適用于不穩(wěn)定的生物分子，盡管在生產(chǎn)率方面存在挑戰(zhàn)，但對(duì)基于核酸的藥物是有利的。

將核酸（如siRNA和mRNA）摻入納米纖維支架中模擬細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于組織和干細(xì)胞工程至關(guān)重要。包裹在納米纖維支架內(nèi)的sirna作為控釋儲(chǔ)存庫(kù)，提供潛在的長(zhǎng)期基因治療效果，并指導(dǎo)和支持種子細(xì)胞。為此，在細(xì)胞培養(yǎng)基中不容易溶解的疏水聚合物，如聚己內(nèi)酯或聚（丙交酯-共聚物），常被用作基質(zhì)。

靜電紡絲生產(chǎn)的聚合物納米纖維適用于透皮治療系統(tǒng)和制造傷口敷料。此外，已有大量報(bào)道表明，它們可通過(guò)口服給藥、粘膜疫苗用于舌下應(yīng)用以及粘膜組織（如眼睛、肺和陰道）的局部藥物治療，在胃腸道中進(jìn)行部位特異性藥物釋放。展望了將核酸藥物摻入聚合物基納米纖維的發(fā)展前景。靜電紡絲作為一種室溫工藝，是一種有前途的替代冷凍干燥固化核酸藥物的方法。在納米纖維直接應(yīng)用于患者的情況下，更有可能選擇最終溶解或降解的高水溶性聚合物。

本研究使用水溶性聚乙烯醇（PVA）作為藥物制劑中普遍使用的賦形劑，作為納米纖維包封sirna（一類核酸療法）的基礎(chǔ)基質(zhì)。最近的報(bào)道已經(jīng)證明了聚乙烯醇納米纖維在藥物傳遞應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)了它們?cè)诳蒯尯蜕锵嗳菪苑矫娴臐摿Α?/span>

PVA的物理特性主要包括它的水溶性，它的水解度（羥基與乙?；谋壤┖途酆隙龋▎误w數(shù)量）決定了它的水解度。PVA等級(jí)的選擇允許量身定制的親水性，使PVA納米纖維成為核酸藥物控制釋放的有力候選物。通過(guò)交聯(lián)，PVA可以變得不溶性，這是制備傷口敷料時(shí)利用的一種特性。此外，不適合靜電紡絲成納米纖維的材料，如羧甲基纖維素，可以通過(guò)與聚乙烯醇雜交而被改造成納米纖維。將聚乙烯醇與各種功能聚合物相結(jié)合的混合納米纖維的許多應(yīng)用已經(jīng)被記錄在案。例如，具有粘膜粘附和胃潴留特性的結(jié)冷膠/PVA納米纖維，用于傷口愈合的明膠/PVA納米纖維，以及用于透皮給藥系統(tǒng)的殼聚糖/PVA和聚乙烯吡咯烷酮/PVA納米纖維已被開(kāi)發(fā)出來(lái)。因此，綜合分析核酸藥物的包封效率及其細(xì)胞攝取效率與不同等級(jí)PVA的關(guān)系是必要的，以最佳地利用PVA基納米纖維作為傳遞核酸藥物配方的通用平臺(tái)。

在基于納米纖維的核酸藥物配方中，陽(yáng)離子脂質(zhì)或替代轉(zhuǎn)染劑的整合是必不可少的。通常，帶正電荷的核酸藥物形成的配合物與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜進(jìn)行靜電相互作用，促進(jìn)其吸附。隨后，這些復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用被細(xì)胞內(nèi)化，這對(duì)藥物的功能至關(guān)重要。

本研究旨在利用靜電紡絲設(shè)備制備siRNA負(fù)載的納米纖維，并以siRNA為核酸治療劑。siRNA轉(zhuǎn)染選擇1,2-二酰-3-三甲基丙烷（DOTAP），一種帶有季銨基團(tuán)的陽(yáng)離子脂質(zhì)。我們的方法是通過(guò)靜電紡絲將DOTAP/siRNA復(fù)合物嵌入PVA納米纖維中。水解度88%，聚合度高的PVA (GOHSENOL™EG-40P)，常用的藥用賦形劑作為標(biāo)準(zhǔn)品。我們首先用EG-40P制備了DOTAP/ sirna包封的PVA納米纖維，對(duì)制備方法進(jìn)行了優(yōu)化。利用EG-40P納米纖維，研究了不同制備方法對(duì)siRNA細(xì)胞內(nèi)分布和RNA干擾（RNAi）效果的影響。這項(xiàng)評(píng)價(jià)是在A549-Luc細(xì)胞上進(jìn)行的，該細(xì)胞來(lái)源于人類非小細(xì)胞肺癌，具有穩(wěn)定的熒光素酶表達(dá)。此外，還探討了不同PVA等級(jí)（以聚合和皂化程度區(qū)分）對(duì)siRNA抑制熒光素酶活性的影響。

二、摘要

本研究旨在開(kāi)發(fā)聚乙烯醇（PVA）納米纖維，通過(guò)靜電紡絲封裝1,2-二酰-3-三甲基丙烷(DOTAP)/siRNA復(fù)合物，用于遞送核酸類藥物。重點(diǎn)研究了聚乙烯醇的內(nèi)在特性對(duì)體系效能的影響。制備了直徑為300-400 nm的PVA納米纖維，siRNA保持完整，DOTAP/siRNA復(fù)合物均勻分散。通過(guò)將DOTAP/siRNA復(fù)合物摻入PVA納米纖維中，并評(píng)估其RNA干擾（RNAi）活性對(duì)A549-Luc細(xì)胞的影響，觀察到對(duì)熒光素酶表達(dá)的穩(wěn)定抑制。對(duì)納米纖維制備過(guò)程的研究表明，即使將DOTAP或siRNA分別添加到PVA溶液中，而不形成復(fù)合物，RNAi效應(yīng)仍然存在。PVA納米纖維釋放的DOTAP/siRNA復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)化，一些PVA殘留物殘留在其表面。強(qiáng)調(diào)了聚乙烯醇水解度和聚合度對(duì)納米纖維性能的影響。值得注意的是，低水解度的PVA顯著增強(qiáng)了RNAi效應(yīng)，熒光素酶表達(dá)抑制率達(dá)到91.5±0.7%。通過(guò)陰離子或陽(yáng)離子修飾的PVA級(jí)納米纖維也被評(píng)估，表明它們影響siRNA遞送的功效。所獲得的見(jiàn)解為進(jìn)一步優(yōu)化藥物輸送系統(tǒng)的未來(lái)研究提供了途徑。

三、結(jié)論

本研究旨在通過(guò)在PVA納米纖維內(nèi)包封DOTAP/siRNA復(fù)合物，開(kāi)發(fā)一種利用靜電紡PVA納米纖維的核酸藥物遞送系統(tǒng)，并闡明siRNA包封納米纖維的特性，包括其RNAi活性。結(jié)果表明，靜電紡絲可以有效地將DOTAP/siRNA復(fù)合物封裝在PVA納米纖維中。即使直接將每種組分添加到PVA溶液中，繞過(guò)DOTAP/siRNA復(fù)合物制備過(guò)程，也可以觀察到對(duì)熒光素酶表達(dá)的穩(wěn)定抑制。此外，PVA納米纖維釋放的DOTAP/siRNA復(fù)合物表面含有PVA殘基，這表明PVA的性質(zhì)可能影響復(fù)合物與細(xì)胞之間的相互作用。因此，水解和聚合的程度，或PVA的等級(jí)，影響熒光素酶的表達(dá)抑制，低水解度的PVA觀察到更高的RNAi活性。盡管攜帶電荷的改性PVA目前尚未被批準(zhǔn)作為藥物輔料，但對(duì)熒光素酶表達(dá)的強(qiáng)烈抑制表明，將帶電聚合物與PVA混合可能會(huì)產(chǎn)生更有效的納米纖維，用于將核酸藥物輸送到細(xì)胞中。

圖1.PVA （EG-40P）納米纖維釋放的DOTAP/siRNA復(fù)合物對(duì)熒光素酶表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)分布的抑制(a)左邊的原理圖說(shuō)明了用BioRender.com創(chuàng)建的含有DOTAP/ sirna的PVA納米纖維（N/P比= 5）的制備方法。圖的右側(cè)顯示了不同制備方法對(duì)A549-Luc細(xì)胞基因表達(dá)抑制率的影響。圖中柱狀圖表示平均值±SD （n = 3）。(b) A549-Luc細(xì)胞中FITC-PVA和TAMRA-siRNA的胞內(nèi)分布。用FITC-PVA和TAMRA-siRNA在無(wú)血清培養(yǎng)基中與完全溶解的含DOTAP/ sirna的PVA納米纖維溶液孵育4小時(shí)后，拍攝CLSM圖像。標(biāo)尺：10 μm。

圖2.掃描電鏡（SEM）圖像的DOTAP/ sirna含PVA納米纖維（N/P = 5）使用不同等級(jí)的PVA。采用方法a制備PVA納米纖維。標(biāo)尺：5 μm。(a) PVA20-88 (EG-30P), (b) PVA6-88 (EG-05P), (c) PVA25-80 (KH-20), (d) PVA17-98 (NH-18), (e)陽(yáng)離子PVA (K-434), (f)陰離子PVA （T-330）。